Análisis del papel de ABCG2 en la activación de células renales por cristales de urato monosódico (MSU) mediante la transfección de un sgRNA específico utilizando la técnica CRISPR-Cas9

Resumen

Antecedentes / Objetivo
La función de ABCG2 como transportador de urato se dedujo a partir de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) y estudios funcionales posteriores, los cuales demostraron específicamente su importancia en la eliminación del ácido úrico en diferentes tejidos. Estudios subsiguientes han mostrado asociaciones entre polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en ABCG2 con hiperuricemia y gota, particularmente un SNP (rs2231142; Q141K), que recientemente ha sido vinculado a la enfermedad. La proteína asociada a Cas9 es una endonucleasa que utiliza una secuencia guía dentro de un ARN dúplex, tracrRNA:crRNA, también llamado ARN guía único (sgRNA). La técnica que emplea esta enzima puede editar el genoma de forma permanente y estable, lo que la hace relevante para silenciar el gen ABCG2 y examinar cómo afecta la activación inflamatoria en modelos de gota.
Objetivo: Desarrollar y analizar una secuencia específica de sgRNA para silenciar la expresión génica de ABCG2 en células HEK293T.

Métodos
Se utilizó la plataforma Horizon Discovery y su herramienta de diseño CRISPR para obtener la secuencia de sgRNA en el exón 8 del gen ABCG2. La transfección se realizó sembrando células en placas de 96 pocillos hasta alcanzar el 80 % de confluencia, y posteriormente se reemplazó el medio de cultivo por medio de transfección que contenía el sistema CRISPR-Cas9 con la secuencia específica y DharmaFECT como vehículo de transfección. Una vez completada la transfección, se evaluó su eficacia mediante la cuantificación de la expresión génica por qRT-PCR, y la expresión de la proteína ABCG2 mediante western blot e inmunofluorescencia.

Resultados
Se observó una disminución tanto en la expresión génica como en la expresión de la proteína (por western blot) de ABCG2 en algunos grupos de células transfectadas. Se determinó la expresión basal de ABCG2 mediante inmunofluorescencia y se analizó la expresión de IL-1β con cristales de MSU a las 24 horas, así como la expresión de IL-1β mediante RT-PCR.

Conclusión
Se obtuvieron líneas celulares HEK293T editadas que expresan una menor cantidad de ABCG2 para su posterior secuenciación.

PALABRAS CLAVE: Gota, ABCG2, CRISPR-Cas9, MSU