Effect of Dp71 point mutations on the subcellular localization of Braf35 and posttranslational modifications of H3 histone.

Abstract

Introducción. La Dp71 es una isoforma del gen DMD, involucrado en el desarrollo de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) que provoca deterioro muscular progresivo. Las mutaciones en Dp71, además del fenotipo muscular, afectan el neurodesarrollo. La Dp71 también se ha descrito en distintos tipos de cáncer, en donde puede participar como oncogén o como represor de tumores dependiendo de diversos factores. En nuestro grupo de trabajo analizamos el papel de las mutaciones patológicas Dp71-C272Y y E299del, las cuales se han reportado en pacientes DMD. Estas mutaciones provocan deslocalización de Dp71 y formación de agregados en distintas líneas celulares. Además, en un modelo neuronal afectaron la organización de proteínas como Braf35 e iBRAF, miembros del complejo LSD1-coREST que regula la expresión de genes de diferenciación neuronal y eritroide, participa en la organización de cromatina y regula la dinámica de demetilación de histonas. En este trabajo nos proponemos analizar si las mutantes de Dp71 afectan la localización subcelular de Braf35 en un modelo celular no neuronal, así como de algunas modificaciones postraduccionales de histonas relacionadas con LSD-coREST.

Objetivo. Analizar el efecto de la expresión de dos mutantes patológicas de Dp71 sobre la localización subcelular de Braf35 y la organización de modificaciones postraduccionales de histonas.

Metodología. En extractos de células Hela se realizaron ensayos de western blot para verificar la expresión endógena de BRAF35 e iBRAF. Células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con vectores que expresan a las mutantes Dp71-C272Y y E299del fusionadas a GFP, y Dp71 wil-type como control. Se realizaron ensayos de inmunofluorescencia con anticuerpos para emerina, BRAF35, H3K9me2, H3K4me3 y H3K14ac. Para analizar los agregados de Dp71 se realizaron 3 ensayos independientes, se analizaron por microscopía confocal y se cuantificaron 30 células en cada caso. La significancia estadística se obtuvo por ANOVA. Los ensayos de inmunofluorescencia se realizaron por duplicado, y se analizaron al menos 15 células en cada experimento mediante microscopía de epifluorescencia.

Resultados. Las células HeLa mostraron la expresión de Braf35 e iBRAF, siendo mayor la expresión de Braf35, lo cual concuerda con su función. Las mutantes de Dp71 mostraron una localización subcelular alterada, destacando la formación de agregados en más del 50% de las células analizadas, lo que apunta a alteración de sus funciones. Emerina, un componente de la envoltura nuclear asociada a Dp71, bajó su expresión y se deslocalizó en presencia de las mutantes. Braf35 mostró una clara disminución en las células que expresan a las mutantes, mientras que las marcas epigenéticas H3K4me3 y H3K9me2 mostraron alteraciones en su patrón de distribución nuclear. H3K14ac no mostró cambios.

Conclusión. Las mutaciones patológicas C272Y y E299del de Dp71 alteran la distribución de BRAF35 y de algunas marcas epigenéticas, lo que refleja la importancia de la integridad de la Dp71 para la correcta localización de sus proteínas asociadas y su función. La comprensión de los alcances funcionales de la integridad de la Dp71 ayudará a dilucidar los mecanismos moleculares implicados en DMD y en diversos tipos de cáncer.