The inflammatory response in SCA7 is regulated by H3K9Ac and H3K9me3 marks and is reversed using the CRISPR-Cas13 system in a glial cell model.

Abstract

Introducción
La ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7) es un trastorno neurodegenerativo autosómico dominante incurable, caracterizado por ataxia cerebelosa y deterioro visual. Esta enfermedad es causada por la expansión de repeticiones CAG en el gen ATXN7, lo que provoca una ganancia de función tóxica de la proteína ataxina-7. La activación glial y la respuesta inflamatoria son procesos asociados a la neurodegeneración. A pesar del papel que la glía de Müller desempeña en la homeostasis de la retina, se sabe poco sobre la respuesta inflamatoria glial en el contexto de la SCA7. La terapia génica se ha abordado en modelos experimentales de SCA7 mediante oligos antisentido y RNA de interferencia, pero el sistema CRISPR-Cas13 aún no se ha estudiado.
Objetivo
Estudiar los mecanismos de regulación epigenética de la respuesta inflamatoria y evaluar la eficacia del sistema CRISPR-Cas13 en las células MIO-M1-Q64.
Metodología
Se utilizó el modelo celular de SCA7 MIO-M1-Q64 (mutante) y MIO-M1-Q10 (control) derivado de la glía de Müller humana. Se realizaron experimentos de RNA-seq para determinar cambios transcripcionales. Se analizaron los niveles de las modificaciones postraduccionales de la histona H3 mediante ELISA y WB. Mediante ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), se evaluó el enriquecimiento de las marcas H3K9Ac y H3K9me3 en los promotores de IL-1β, IL-6 e IL-8. Mediante coinfección lentiviral, se expresaron la proteína Cas13 y RNAs guía específicos de diferentes regiones del transcrito ATXN7. Se confirmó la expresión del sistema CRISPR-Cas13 mediante microscopía de epifluorescencia. Se realizaron ensayos de RT-qPCR para determinar la expresión de ATXN7, IL-1β, IL-6 e IL-8. Mediante ensayos ELISA se determinaron los niveles de IL-6 e IL-8. Los experimentos se realizaron por triplicado; los datos de ChIP se analizaron por el método de fold-enrichment, los de qPCR por el método ΔΔCt. La significancia estadística fue determinada mediante análisis de t-student o ANOVA utilizando el software GraphPad Prism 11.
Resultados
Se detectó un perfil transcripcional asociado a la activación de la respuesta inflamatoria en las células MIO-M1-Q64, caracterizado por la sobreexpresión de IL-6, IL-1β e IL-8. Identificamos un aumento en la expresión de las marcas epigenéticas H3K9Ac y H3K9me3 en las células MIO-M1-Q64, con un mayor enriquecimiento de la marca de activación H3K9Ac y una menor abundancia de la marca de represión H3K9me3 en los promotores de los genes IL-1β e IL-6. Tras la expresión del sistema CRISPR-Cas13, se detectó una disminución de la expresión de ataxina-7 y de los niveles de IL-6, tanto a nivel de transcrito como de proteína.
Conclusiones
La expresión de ataxina-7 induce un ambiente inflamatorio en las células MIO-M1-Q64, caracterizado por la sobreexpresión de las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-1β regulada por las marcas H3K9Ac y H3K9me3. Los niveles elevados de IL-6 se revirtieron tras la expresión del sistema CRISPR-Cas13 dirigido al transcrito mutante de SCA7. Nuestros datos indican la presencia de mecanismos epigenéticos desregulados en la glía de Müller que favorecen la respuesta inflamatoria. El sistema CRISPR-Cas13 demostró su eficacia in vitro, lo que lo sitúa como una posible aplicación terapéutica para la SCA7.