In vitro characterization of the effect of Betanin on the myogenic commitment of C2C12 myoblasts

Abstract

Introducción: La Betanina es uno de los pigmentos más abundante del reino vegetal y es ampliamente utilizada en la industria farmacéutica y cosmética como colorante.  Sin embargo otros efectos con función biológica como la actividad antioxidante y antiinflamatoria actualmente han sido caracterizados. La capacidad de la Betanina para reducir el estrés oxidante ha mostrado ser benéfico en diversos estudios contribuyendo a la viabilidad, proliferación y sobrevivencia celular. Pero en el tejido muscular la regulación del estrés oxidante es altamente controlado, debido a que su inhibición puede impactar en el proceso de diferenciación miogénica, que es indispensable para la formación y reparación del tejido muscular. Nuestro estudio es el primero en esclarecer el efecto de Betanina en la diferenciación de células progenitoras miogénicas C2C12.

Objetivo: Caracterizar in vitro el efecto de dosis altas de Betanina sobre la viabilidad y la expresión de cadena pesada de miosina (MHC) en células C2C12 en diferenciación.

Metodología: Cultivo celular: Los mioblastos C2C12 fueron sembrados en platos de 35 mm, se mantuvieron 3 días en incubación con medio de crecimiento en condiciones de normoxia. Al tercer día se cambio a medio de diferenciación, al mismo tiempo se administraron las dosis de 5, 10, 20 y 40 mg/ml de Betanina. La administración fue cada 48 horas por 4 días. Viabilidad: Las células en diferenciación fueron retiradas de la incubadora y lavadas, el medio fue sustituido con MTT (0.25 mg/ml), se incubaron durante 3 h, terminado este tiempo el exceso fue retirado, el formazán fue eluído con DMSO y leído a 570 nm. Western Blot: A las 96 h de exposición las proteínas fueron extraídas, separadas y transferidas a una membrana de nitrocelulosa, se incubaron los anticuerpos primarios toda la noche, las membranas lavadas fueron incubadas con sus respectivos anticuerpos secundarios 1 h a temperatura ambiente, posteriormente fueron lavadas y reveladas

Resultados: La viabilidad de las células C2C12 durante el proceso de diferenciación tratadas con diferentes dosis de Betanina no mostraron diferencias significativas con respecto al control, tras 48 h de exposición. Este mismo resultado fue observado después de 96 h de tratamiento con la molécula en sus diferentes concentraciones. Sin embargo también se observó cualitativamente que 40 mg/ml, aunque no afectaba la viabilidad evito la formación de miotubos.  Interesantemente en miotubos maduros de 6 días de diferenciación la dosis de 40 mg/ml disminuyo significativamente la viabilidad de las células en cultivo.  Por otro parte la expresión de MHC como un marcador de diferenciación miogénica, se vio disminuida con dosis mayores a 5 mg/ml de Betania comparadas con su control a las 96 h.

Conclusiones: Los mioblastos C2C12 en etapas tempranas de la diferenciación son viables con hasta 40 mg/ml de Betanina, pero pierden su capacidad de expresar su fenotipo miogénico al ser expuestos a dosis mayores que 5 mg/ml. Por lo que resulta importante considerar este efecto sobre el músculo esquelético con el uso de Betanina como tratamiento principal o adyuvante. Para comprender los mecanismos moleculares de la inhibición de la diferenciación miogénica se ameritan más estudios.