Estimulación de la expresión de mediadores anti-inflamatorios, en cultivos de células troncales mesenquimales humanas, para promover la reepitelización.

Abstract

INTRODUCCIÓN: Los sustitutos transitorios de piel (STP) son productos biológicos utilizados como cobertura en quemaduras, reducen la necesidad de auto injertos y aceleran la reepitelización. El potencial terapéutico de las células troncales mesenquimales de tejido adiposo (AD-MSC) reside en la liberación de factores contenidos en su secretoma. La óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) es sintetizada en respuesta a citocinas para producir óxido nítrico (NO) durante la recuperación de la herida, vasodilatación y aumento de colágena. El VEGF es un factor angiogénico potente relacionado con la iNOS. La IL-10 es una citocina pro-resolutoria que participa en la disminución de la inflamación. Estas moléculas están involucradas en la comunicación intercelular y reepitelización de tejido. Son un elemento esencial para el desarrollo de un sustituto transitorio de piel y una estrategia terapéutica libre de células. OBJETIVO: Estandarizar un protocolo de estimulación pro-inflamatoria para promover la expresión de mediadores anti-inflamatorios en cultivos de células troncales mesenquimales. METODOLOGÍA: Se aislaron AD-MSC, se analizó el fenotipo CD73+, CD90+, CD105+, CD34-, CD43-, HLA-DR- por citometría de flujo y su multipotencialidad. Las hMSC se sembraron a una densidad de 15,000 células/cm² y se mantuvieron por 24 h en medio de cultivo bajo en glucosa. Se aplicó un estímulo pro-inflamatorio con TNF-α, IFN-γ, IL-1α o una combinación de las tres (MIX) durante 24 h. Se retiró el estímulo  y 48 h después se analizó la viabilidad celular con ensayo de calceína. Se extrajeron proteínas y se analizó la expresión de iNOS (110-120 kDa), IL-10 (18 kDa) y VEGF (38 kDa) por Western blot. RESULTADOS: Se confirmó la expresión de marcadores mesenquimales CD73 (97.3%), CD90 (99.5%), CD105 (99.4%) y la baja expresión de los marcadores hematopoyéticos CD34 (7,86%), CD43 (0.57%) y HLA-DR (0.77%). La tinción de azul alciano positiva confirmó la multipotencialidad. Se estandarizó la estimulación pro-inflamatoria con TNF-α [25 ng/mL], IFN-γ [25 ng/mL], IL-1α [50 ng/mL], la cual indujo una forma elongada e irregular, con ligeros cambios en la adhesión celular. La viabilidad fue: Control (97.44% vivas, 2.56% muertas), TNF-α (97.47%, 2.53%), IFN-γ (97.17%, 2.83%), IL-1α (96.99%, 3.01%), y el MIX (87.88%, 12.12%). Identificamos la expresión de iNOS, IL-10 y VEGF y cambios relacionados con el tipo de estimulación. Para iNOS no se observó expresión en CTL; IL-1α e IFN-γ indujeron una ligera expresión mientras que con TNF-α y MIX el aumento en fue marcado. Para IL-10, la expresión en el CTL y tratamiento con IL-1α fue similar, mientras que IFN-γ y TNF-α mostraron un incremento marcado aditivo. Para VEGF la expresión entre el CTL, IFN-γ y TNF-α fue similar con un ligero incremento en IL-1α, similar al MIX. CONCLUSIÓN. El modelo de estimulación pro-inflamatoria en cultivos de AD-MSC generó cambios morfológicos y metabólicos pero se mantuvo su viabilidad celular. También indujo cambios en la expresión de iNOS, IL-10 y VEGF, mediadores de la inflamación durante el proceso de recuperación de la herida. Estos resultados permitirán utilizar el protocolo de estimulación pro-inflamatorio para el desarrollo de un sustituto transitorio de piel que incorpore una estrategia terapéutica libre de células.